Skvrny od spermatu.

Jestliže neprokážeme alespoň jednu celou spermii, pokusíme se o nepřímý důkaz spermatu zjištěním látek, které jsou v něm hojně obsaženy. Přítomnosti spermatu ve skvrně pak obvykle nasvědčuje teprve průkaz několika charakteristických látek.

• Průkaz acidfosfatázy - Kyselá fosfatáza je enzym, který se ve vysoké koncentraci nachází v prostatických sekretech (enzymatická aktivita je 100 - 500krát vyšší než u jiných fosfatáz). V suchém stavu (ve skvrnách spermatu) je aktivita tohoto enzymu relativně stálá (měsíce až roky), v prostředí pochvy se však jeho detekovatelnost udává do asi 14 hodin. Principem důkazu je schopnost acidfosfatázy (přítomné ve skvrně) odštěpit z přidaného substrátu (např. alfa-naftylfosfát, fenolftaleindifosfát) fosfát, což lze prokázat barevnou reakcí (kdy např. ze substrátu uvolněný alfa-naftol vede ke vzni­ku barevného diazoniového produktu s Fast blue B či uvolněný fenoltalein změní barvu v parách amoniaku). Někdy je snaha rozlišit ve skvrnách acidfosfatázu prostatickou od endogenní, resp. vaginální, např. na základě inhibice aktivity acidfosfatázy kyselinou vinnou (resp. kyselým vinanem sodným) nebo elektroforetickým rozlišením izoenzymů. I když vyšetření acidfosfatázy ve skvrně představuje vysoce citlivou reakci, sama o sobě není pro důkaz spermatu dostatečně specifická, neboť žlázky v okolí ústí močové trubice u ženy produkují acidfosfatázu obdobných vlastností, jako má prostatická. Její aktivita byla prokázána ve skvrnách na prádle osob ženského pohlaví od dětského až do vysokého věku prokazatelně bez příměsi spermatu. Komerčně jsou vyráběny diagnostické proužky, které dle údajů výrobce prokazují prostatickou acidfosfatázu specificky.

            Barevná (pozitivní) reakce při průkazu acitfosfatázy v druhé, respektive prostřední misce.

• Stanovení přítomnosti specifického prostatického antigenu - Prostatický antigen (PSA) je glykoprotein produkovaný téměř výhradně epitelovými buňkami prostaty. Jeho sekrece může být zvýšena z různých příčin - např. po biopsii prostaty, po transuretrální prostatektomii, při akutní retenci moči či akutním zánětu prostaty, po ejakulaci (jen krátkodobě a nepříliš významně). Hlavní příčinou problémů při diferenciálně diagnostickém hodnocení je skutečnost, že zvýšená hladina PSA pravidelně provází nejen karcinom, ale i chronickou benigní hyperplazii prostaty. Prostatický antigen je stabilní, v pochvě jej lze prokázat až 27 hodin po styku. Je známo několik metod stanovení PSA založených na imunitní reakci se specifickou protilátkou - od difuzních a imunoelektroforetických až po metody ELISA.

           Určování PSA pomocí detekční proužků (podobný princip jako při zjišťování HCG při průkazu těhoteství):

            Negativní PSA                                                Pozitivní PSA

• Průkaz sperminu a cholinu - Sperma obsahuje velké množství sperminu a cholinu, které lze prokazovat chromatograficky či elektroforeticky. Průkaz těchto látek ve skvrně spolu s reakcí acidfosfatázy většinou již nasvědčuje tomu, že vyšetřovaná skvrna obsahuje sperma. Detekčním činidlem je Dragendorfovo činidlo (dusičnan vizmutitý, jodid draselný a kyselina octová).

            Pozitivní výsledky průkazu sperminu a fruktózy.

• Prúkaz některých dalších látek - K dalším látkám, které obsahuje sperma v hojném množství, patří například fruktóza či kyselina citrónová, které lze prokazovat chromatograficky. Pomocí 1,2-pyridylazo-2-naftolu (PAN) byla ve skvrnách od spermatu prokazována přítomnost zinku.

• Průkaz gama-seminoproteinu - Pomocí specifické protilátky lze gama-seminoprotein prokázat imunoprecipitační reakcí, např. dvojitou radiámí imunodifuzí. Průkaz seminoprolein vysoce specifický.

• Průkaz lidského spermatu metodou SPERM HY-LITER™ - Metoda je založena na fluorescenční detekci lidského spermatu. Reakce je druhově specifická (monoklonální) - fluorescenční barva reaguje pouze s lidskými spermiemi. Pozitivní výsledek je prezentován fluorescenčním zbarvením hlavičky spermie, kdy hlavička v mikroskopu „svítí“. Test reaguje pozitivně pouze se spermiemi, ne s vaginálními buňkami, epiteliálními buňkami ústní sliznice apod. Výhodou testuje nožná návaznost specifického průkazu lidského spermatu na mikrodisekční metodu, cerá umožňuje zviditelněné spermie „vyříznout“ z preparátu za účelem genetického zkoumání.

• Stanovení přítomnosti semenogelinu - Imunochromatografický test RSID-Semen na specifický průkaz lidského spermatu je založen na detekci semenogelinu, proteinu produkovaného semennými váčky, který způsobuje koagulaci spermatu po ejakulaci. Test je pozitivní i u aspermiků. Testy nevykazují křížové reakce s jinými lidskými tekutinami (krev, menstruační krev, sliny, moč, vaginální sekret aj.) nebo se spermatem zvířat (testováno se spermatem hovězím, prasečím, psím, kozím a ovčím). Samotné sperma se ve vyšetřovaných vzorcích vyskytuje ojediněle, většinou se nachází v různých směsích, nejčastěji s poševním sekretem, slinami, krví a anorganickými nečistotami. V  prostředí pochvy jsou spermie detekovatelné i přibližně po 48 hodinách.