Krevní stopy.

• Metoda Lattesova: Aglutininy jsou prokazovány ve skvrně nebo její části pomocí náplavu testovacích erytrocytů známé krevní skupiny - A a B. Pokud jsou v krevní skvrně přítomny aglutininy, způsobí aglutinaci přidaných testovacích erytrocylů příslušné krevní skupiny. Na základě hemaglutinace pak lze usuzovat, které aglutininy jsou ve zkoumané krevní skvrně přítomny, což umožní definovat skupinovou vlastnost krve. Vyšetření se provádí obvykle na podložním sklíčku a po fázi inkubace ve vlhké komůrce se přítomná aglutinace testovacích krvinek hodnotí mikroskopicky. Podrobné vyšetření je nutno vždy doplnit průkazem skupinových substancí A, B, H (aglutinogenů) ve skvrně.

• Metoda dle Laupyho: Jde o modifikaci předcházející metody s tím, že vyšetření aglutininů skvrny probíhá ve zkumavkách. Je tak vytvořen lepší předpoklad pro odstranění případných artefaktů.

• Vysycovací metoda dle Therkelsena (někdy nazývaná metodou absorpčně inhibiční): Principem této metody je průkaz absorpce protilátek anti-A, anti-B nebo anti-H na skupinové substance zkoumané krevní skvrny. Míru vysycení protilátek hodnotíme na základě poklesu jejich titru. Přidáme-li ke krevní skvrně protilátku (anti-A, anti-B či anti-H), pak při přítomnosti některé ze skupinových substancí (A, B či H) dojde ve fázi absorpce k vazbě protilátky a titr použité protilátky se sníží (resp. protilátka bude v důsledku vzniklé vazby do určité míry vysycena). Vyšetření se provádí ve zkumavkách (nebo na mikrotitračních destičkách), kde v jedné řadě zkumavek (nebo jamek) je geometrickou řadou ředěna fyziologickým roztokem protilátka anti-B, ve druhé řadě protilátka anti-A. Titr protilátky pak určíme podle aglutinace homologních testovacích erytrocytů přidaných do každé zkumavky. Míru vysycení posoudíme porovnáním zjištěného titru po absorpci s výchozím titrem protilátky.

         Absorpčně inhibiční metada na mikrotitrační destičce, kde jsou pod písmenem A a B testovány 2 různé krevní vzorky, v první sérii jamek je testovaný vzorek, v druhé kontrolní vzorek a ve 3. řadě inertní materiál, který slouží jako druhá     kontrola. Výsledkem skupiny "A" a "AB".

• Metoda smíšené aglutinace: Ve fázi absorpce dojde k vazbě příslušné protilátky (anti-A, anti-B, anti-H) na sku­pinovou substanci skvrny. Při následném promytí chladným fyziologickým roztokem vyplavíme veškeré nenavázané protilátky. Poté náplavem testovacích homologních erytrocytů ověřujeme přítomnost navázané protilátky, která kromě vazby na skupinovou substanci krevní skvrny je schopna ještě aglutinovat testova­cí erytrocyty. Aglutinaci hodnotíme mikroskopicky v různých časových odstupech (za 1, 2, 4, 6 i více hodin) přímo na zkoumaném vzorku, např. na krví potřísněném vláknu.

Při zjišťování krevních skupinových vlastností je vhodné dodržovat určité zása­dy. Vždy kromě samotné krevní skvrny vyšetřujeme též krví nepotřísněnou podložku, na které se skvrna nalézá. Dojde-li k pozitivní reakci pouhé podložky s některou protilátkou (anti-A, B či H), tak nám to obvykle znesnadní, resp. omezí interpretaci výsledků vyšetření krevní skvrny.

Při dostatečném množství materiálu zkoumaného vzorku provádíme zásadně vyšetření dvěma metodami. Někdy je možno využít kombinaci metody vysycovací a absorpčně elučního testu, kdy po fázi absorpce je jednak změřen titr použité pro­tilátky (metoda vysycovací), jednak je vzorek dále vyšetřen metodou absorpčně eluční. Někdy se tento postup nazývá dvojokruhový systém. Volba metody k vyšetření skupinových vlastností krevní skvrny je ovlivněna zejména dostupným množstvím materiálu k vyšetření a do určité míry též podlož­kou, na které se krevní skvrna nachází. K nejnáročnějším na spotřebu materiálu patří metoda vysycovací (asi 30 - 40 mg krve), podstatně méně náročná je absorpč­ně eluční metoda, nejcitlivější je smíšená aglutinace, kterou lze vyšetřovat např. i  fragmenty vláken potřísněných krví. Pouze u metody vysycovací můžeme provést vyšetření šupinek zaschlé krve přímo, pro absorpčně eluční test a smíšenou aglutinaci musí být krevní skvrna na nosiči - podložce, na které je její zpracování prováděno. Čerstvou krevní skvrnu - pro její rychlou rozpustnost - je vhodné před užitím absorpčně elučního testu nebo metody smíšené aglutinace fixoval (např. zvlhčením metanolem). Při výskytu skupinové substance A lze výše uvedenými metodami v krevní skvrně většinou posoudit i nejčastější podskupiny A1, A2. K vyšetření bývají často užívány lektiny anti-A1 a anti-H.

Krevní skupinové vlastnosti systému ABO(H) jsou relativně stabilní a lze je do­kázat i po velmi dlouhé době, ale vlivem enzymů některých mikroorganismů mohou ryt narušeny, případně změněny.