Krevní stopy.

1. Krevní stopy

Základní otázky:

1.1. Krev

V  rámci jednotlivých etnických skupin existují rozdíly v zastoupení krevních skup: V České republice je průměrné rozvrstvení krevních skupin následující: A - 42  %, B - 18 %, 0 - 32 %, AB - 8 %, Rh+ - 85 %, Rh- - 15 %.

1.2. Detekce krevních stop

Krevní skvrny jsou většinou viditelné prostým okem. Špatně je krev patrná na tmavých vsakavých látkách. V rámci trestné činnosti se často setkáváme s pokusy o odstranění krve z oděvu nebo předmětů. Možnost jejich odstranění závisí na charakteru a vlastnostech podkladového materiálu a na činidle použitém ke zničení krevních stop. Většinou však lze i po použití detergentů nebo jiných agresivních činidel prokázat minimální množství krevního materiálu.

Krevní stopy jsou stabilní, pokud se nacházejí v suchém stavu a nejsou vystaveny přímému slunečnímu záření (resp. jinému záření). Ve vlhkém prostředí podléhají snadno degradaci vlivem bakteriální kontaminace. Aglutinogeny jsou s ohledem na svou chemickou podstatu odolnější vůči teplotě (varu) než aglutininy, které jsou bílkovinné povahy.

Detekci krevních stop a aplikaci orientačních zkoušek lze provést jak na místě činu, tak v laboratoři.

1.3. Nespecifické metody

• Plošná detekce (perioxidázové zkoušky) - ke zviditelnění latentních stop se používají chemická činidla a vhodné osvícení. K vyhledávání „neviditelných“ krevních skvrn lze úspěšně využít fialové světlo o vlnové délce v rozsahu 380 - 400 nm. Jsou známa barviva na zviditelňování krevních stop, např. amidová čerň, benzidin, malachitová zeleň, luminol nebo fenolftalein. Většina zkoušek využívá aktivity krevní peroxidázy a katalázy, které mají schopnost štěpit peroxid vodíku, jenž je vázán v činidle nebo v indikační plošce detekčních proužků. Reakcí uvolněný kyslík reaguje s barvotvomou složkou obsaženou rovněž v roztoku či v plošce proužku (např. o-tolidin) za vzniku chemoluminiscence či změny zbarvení indikační plošky. Peroxidázové zkoušky se vyznačují vysokou citlivostí, ale z hlediska detekce i vyšetření krve také nízkou specifičností, protože peroxidázy a katalázy se vyskytují v rostlinných pletivech, ovocných šťávách, hnisu aj. Zelenání reagenčních proužků vyvolávají i sloučeniny železa na povrchu korodovaných materiálů.

           Potřeby k peroxidázové zkoušce.                 Pozitivní reakce peroxidové zkoušky charakteru zpěnění peroxidu naneseného na skrvnu.

• Bluestar® Forensic™ je patentované barvivo vyvinuté speciálně pro práci na místě trestného činu při vyhledávání latentních krevních stop. Je vhodné při práci interiéru i v exteriéru, na zaschlé, umyté nebo silně zředěné stopy. Vzhledem k tomu, že nepoškozuje strukturu DNA, lze krevní stopu dále použít pro genetické zkoumání. Možnou přítomnost krve indikuje emitované modré luminiscenční světlo. Bluestar dává falešně pozitivní reakci s některými prostředky obsahujícími chlor, i některými barvami, laky, mědí a rostlinami obsahujícími železo, např. lišejníky.

• Luminová zkouška - po postříkání je patrná luminiscence namodralé barvy. Zkouška je značně nespecická, bývá pozitivní i se skvrnami od ovoce, zeleniny, rzi, s některými kovy apod. Podmínkou aplikace je tma nebozatemnění (eliminace rušivých zdrojů světla).

           Sada činidel k luminové zkoušce.                Pozitivní reakce luminolové zkoušky charakteru světelkování naneseného roztoku na skvrnu při zatemnění. 

• Lokalizovaná detekce - provádí se pomocí de­tekčních proužků, které se využívají ke klinickému vyšetření krve v moči. Pozitivní výsledek, resp. možnost výskytu krve, indikuje intenzivní, téměř okamžitě vznikající modrozelené zbarvení indikační plošky.

1.4. Specifické metody

Ke specifickému průkazu krve se využívají zpravidla mikrokrystalografické a spek­troskopické metody. Principem těchto metod je průkaz hemoglobinu, případně jeho derivátů v rámci mikrokrystalografických zkoušek.

• Bertrandova zkouška - hemoglobin tvoří s ledovou kyselinou octovou v přítomnosti chloridu hořečnatého při teplotě 120 °C krystalky acetchlorheminu. Jsou to hnědé až hnědočervené krystalky obdélníkového či kosočtverečného tvaru.  Metoda je rychlá, citlivá a specifická.

           Potřeby pro Bertrandovu zkoušku.     Charakteristický obdélnikový a kosočtverečný tvar krystalků acetchlorheminu.

• Hemochromogenová zkouška dle Takayamy - použité činidlo (10% roztok glukózy 5 ml, 10% hydroxid sodný 10 ml, destilovaná voda 65 ml, pyridin 20 ml) vede po zahřátí vzorku za přítomnosti krve ke vzniku hemochromogenových krystalků, které mají růžovou až oranžově červenou barvu a jsou dosti pestrého vzhledu - od drobných pentliček až k obrazu sněhových vloček a tvarům, které připomínají námrazu na skle. Zkouška je rovněž specifická a dává dobré výsledky i se skvrnami starými, zahřátými, hnijícími nebo byla-li skvrna ve styku se zásadami či kyselinami.

          Charakteristický vzhled krystalků hemochromogenu tvaru pentliček až obrazu sněhových vloček či namrázy na skle.

• Mikrospektroskopická zkouška - spočívá v průkazu spektra hemochromogenu vzniklého reakcí hemoglobinu s činidlem užívaným ve zkoušce dle Takayamy. Reakci provedeme na podložním skle a spektrum pozorujeme v mikrospektroskopu, který lze nasadit přímo na tubus mikroskopu. Charakteristické jsou dva absorpční pruhy - jeden sil­nější mezi čarami D a E, další slabší přesahující čáru E.

• Hematoporfyrinová zkouška - vychází z reakce hematoporfyrinu s koncentrovanou kyselinou sírovou, která se projeví živě červenou fluorescencí v UV světle po nanesení kapky kyseliny sírové na zkoumaný vzorek. Metoda je velice citlivá, daří se často i u krevních skvrn naru­šených praním, hnilobou a některými chemickými látkami. Nevýhodou metody je znehodnocení použitého vzorku pro jakékoliv další vyšetření.

• Malachitová zeleň - spolehlivé barvivo rozpustné ve vodě, které prokazuje přítomnost krve. Je vysoce citlivé.

• HexagonOBTI - je určen nejen na stanovení přítomnosti krve, ale také na prokázání jejího lidského původu. Test je založen na imunochemické detekci he­moglobinu reakcí s monoklonální protilátkou proti lidskému hemoglobinu. Test má vysokou citlivost i při vysokém nařední krve.

• Imunochromatografický test RSID (Rapid Stain Identification) - je založen na reakci dvou monoklonálních protilátek proti lidskému glykoforinu A, což je protein obsažený v membránách červených krvinek, který zabraňuje jejich shlukování. Test nevykazuje křížovou reakci s jinými lidskými tělními tekutinami (např. slinami, spermatem, močí, mlékem) nebo s krví zvířat (včetně primátů).

1.5. Určení druhové příslušnosti

Jestliže prokážeme ve zkoumané skvrně krev, je důležité zjistit, zda jde o krev lidskou, event. jakému živočišnému druhu náleží. Tento důkaz nelze v žádném případě opominout a má vždy - i při nedostatku vyšetřovaného materiálu - před­nost před zjišťováním dalších identifikačních znaků (např. krevních skupin). Podstatou je průkaz lidské bílkoviny (ev. bílkoviny jiného živočišného druhu) ve skvrně. Z klasických metod se nejčastěji využívá imunoprecipitační reakce, která je dostatečně citlivá a svým provedením poměrně jednoduchá. Jde o zjištění druhově specifické bílkoviny přítomné v krevní skvrně, která s přidaným sérem (protilátkou) precipituje. Testovací precipitační sérum se získává imunizací jiného živočišného druhu. K vlastní precipitaci dochází v místě optimálních koncentraci navzájem se prolínajících a reagujících látek, tj. bílkoviny ze skvrny a precipitačního séra.

          Pozitivní imunoprecipitační reakce charakteru valu mezi 1 a centrální jamkou. 

Vyšetření se provádí těmito metodami:

• Antiglobulinovým testem, kdy metoda využívá poznatku, že erytrocyty (0 Rh+), které jsou senzibilizované inkompletním sérem anti-D (Rh), aglutinují teprve po přidání séra proti lidskému globulinu (sérum anti-globulinum humanum /SAGH/). Vyšetřujeme výluh ze zkou­mané skvrny. Jestliže ve výluhu z krevní skvrny je přítomen lidský globulin, vy­váže přidané sérum proti lidskému globulinu (SAGH) a zabrání tak hemaglutinaci přidaných připravených senzibilizovaných krvinek (0 Rh+). Pozitivní reakcí, která dokazuje lidskou krev ve skvrně, je tedy inhibice hemaglutinace.

Pomocí precipitačních sér proti bílkovinám živočišných druhů můžeme prokázat ve stopách i jejich krev (např. králičí, prasečí apod.), popř. zjistit, zda skvrna neobsahuje směs krví. Při posuzování přítomnosti bílkoviny příslušného živočišného druhu ve skvrně musíme počítat s příbuzenskou pozitivní reakcí, a to zejména u těchto druhů: člověk - antropoidní opice, kůň - osel - mula - mezek, koza - ovce - muflon, srnec - jelen - daněk, králík - zajíc, slepice - holub - husa - kachna - krocan.

1.6. Určení skupinových vlastností

Krevní skvrna vzniká z plné krve a obsahuje skupinové systémy, které jsou obsa­ženy v krvi a mají význam pro identifikaci. Tyto skupinové systémy se vyznačují různou odolností proti vlivům zevního prostředí a lze je proto prokazovat nestejně dlouhou dobu od vzniku krevní skvrny. Pocházejí z erytrocytů (např. systém ABO, znaky MN, faktor Rh, Kell, P, Duffy, Lewis, Lutheran, enzymové systémy), z lymfocytů (např. HLA systém) nebo ze séra.

Vyšetření krevních skupin A, B, 0, AB

V krevních skvrnách mohou být až po týdny zachovány aglutininy, zatímco skupi­nové substance A, B, H lze prokázat i po řadě let (záleží na prostředí, ve kterém se krevní skvrna nachází).

Průkaz aglutininů:

           Sada pro určování krevních skupin. 

           Přiklady určování krevní skupiny pomocí testovacích erytrocytů a antisér:

           V prvním řádku výsledkem krevní skupina "B M", v druhém řádku krevní skupina "O M".                                                                          

Průkaz krevních skupinových substancí A, B, H:

Poněvadž v krevní skvrně již nejsou zachované plnohodnotné erytrocyty, je nutné skupinové substance, přítomné na membránách rozpadlých krvinek, prokazovat jinými metodami než při vyšetření plné krve. Užívané metody vycházejí z poznatku, že pokud krevní skvrna obsahuje některou ze skupinových substancí (A, B, H), nastane po přidání příslušné protilátky (anti-A, anti-B, anti-H) ve fázi absorpce vazba protilátky na odpovídající skupinovou substanci, kdy pak pouze zjišťujeme, zda k vazbě protilátky na skupinovou substanci skutečně došlo. Metodou vysycovací prokazujeme míru vysycení (snížení titru) nenavázané použité protilátky, metoda absorpčně eluční a metoda smíšené aglutinace naopak prokazuje navázanou protilátku, a to buď po její eluci (metoda absorpčně eluční) nebo přímo na zkoumaném objektu (metoda smíšené aglutinace).

           Mikroskopické hodnocení aglutinace erytrocytů. 

• Metoda absorpčně eluční (Nicholls-Pereira): První fáze představuje absorpci protilátky (anti-A, anti-B či anti-H) na přítomnou skupinovou substanci (A, B či H). Při následném promytí chladným fyziologickým roztokem se vyplaví veškeré nenavá­zané protilátky. V následující fázi eluce pak dojde k uvolnění navázané protilátky z vazby na skupinovou substanci. Eluce probíhá ve zkumavkách obvykle do malé­ho množství fyziologického roztoku při 56 °C v termostatu. Po oddělení eluátu od původního vzorku a po jeho zchladnutí je prokazována přítomnost eluované proti­látky přidáním testovacích homologních erytrocytů. Hodnocení se provádí ve zkumavkách makroskopicky.

1.7. Určení pohlaví z krevní skvrny

Po fixaci nátěru z krevní skvrny a jeho obarvení pomocí Quinacrin mustard prokazujeme Y-chromozom ve fluores­cenčním mikroskopu jako drobné fluoreskující tělísko na vnitřní straně jaderné membrány lymfocytů. Četný nález, zejména při velkém počtu pro­hlédnutých buněk (100 - 200) svědčí pro skutečnost, že krev ve skvrně pochází od muže.

Fluorescence Y-chromozomu navíc svědčí pro druhovou příslušnost (lidský původ), neboť jiné živočišné druhy zmíněnou fluorescenci nevykazují.

Průkaz hormonálních hladin

Citlivými metodami - např. radioimunoesejí - lze i v krevní skvrně zjistit rozdíly hladin některých mužských a ženských hormonů, zejména testosteronu, progesteronu a estradiolu.

1.8. Původ krevních stop

Z krevní stopy se dále snažíme upřesnit údaje o jedinci, který krvácel, popř. určit i místo na těle, odkud krvácení vzniklo.

Menstruační krev

Těhotenská krev

Její určení má značnou důležitost při podezření na vraždu novorozeného dítěte či kriminální potrat. K průkazu se používají:

• Běžné těhotenské testy (kvalitativní imunoanalýza), které jsou určeny pro kvalitativní stanovení lidského choriogonadotropinu (hCG) ve vzorku krve  nebo moči. Lidský choriogonadotropin je glykopeptidový hormon produkovaný placentou v průběhu těhotenství.
• Imunologický test průkazem choriongonadotropinu, kdy princip reakce spočívá v inhibici hemaglulinace. Senzibilizované krvinky jsou aglutinovány sérem proti choriongonadotropinu tehdy, jestliže toto sérum není vázáno choriongonadotropinem zkoumané krevní skrvny. Aglutinace se projeví žlutohnědou sraženinou v centru dna reagenční zkumavky negativní výsledek. Naopak inhibice hemaglutinace je charakterizována vznikem hnědého prstence po obvodu dna zkumavky a znamená pozitivní reakci, neboť choriongonadotropin skvrny vázal sérum, které pak již nemohlo aglutinaci vyvolat
• Hyperémický test vychází z účinku choriongonadotropinu obsaženého v těhotenské (tedy i krevní skvrně), který po injekční aplikaci výluhu ze skvrny infantilním bílým krysám u nich vede k hyperemii ovárií.

Krev plodová, novorozenecká, kojenecká

• Zjištění alfa-1-fetoproteinu pomocí specifické protilátky imunoprecipitační reakcí dvojitou radiámí imunodifuzí v agaru, popřípadě elektroimunoprecipitací. Koncentrace alfa-1-fetoproteinu dosahuje maxima 11 .- 14. týdnem nitroděložního života. Nevyskytuje se u dětí starších 6 - 7 měsiců a dospělých jedinců.
• Průkaz rezistence hemoglobinu proti alkáliím a kyselinám - Hemoglobin plodu (Hb F) novorozence i kojence je podstatně odolnější vůči alká­liím i kyselinám než hemoglobin (Hb A) dospělých. Zmíněná rezistence přetrvává někdy až do věku 6. - 7. měsíců. K vyšetření se používá roztok 2% hydroxidu draselného, který se ve stejném množství přidá k výluhu ze zkoumané krevní skvrny. Vzniká postupně alkalický hematin, což se projevuje změnou barvy. U výluhu z krevní skvrny dospělého člověka dochází k uvedené změně do několika minut; jestliže krev pochází z plodu, novorozence či kojence, trvá přeměna podstatně déle (někdy 4 ho­diny i více). Obdobně lze provést vyšetření i s kyselinou chlorovodíkovou, kdy za obdobných podmínek a časových relací vzniká kyselý hematin. Vždy je nutno pro kontrolu provést souběžně vyšetření známých vzorků krve z novorozence i dospě­lého.
• Průkaz adultního a fetálního hemoglobinu - např. papírovou chromatografií v horizontální kruhové úpravě nebo elektroforeticky.

1.9. Určení stáří krevní skvrny

Stáří krevních skvrn přesně určit nedovedeme. Skvrna podléhá různým zevním vli­vům (sluneční světlo, vlhkost, vysušení, podložka, mikroorganismy, plísně, rez, čisticí prostředky aj.), kterým je vystavena. Tím ve skvrně probíhají rychleji nebo pomaleji změny, které se snažíme k určení doby vzniku krevní skvrny využít.

• Chloridový test - Ionty chloru, které jsou obsaženy v krevní skvrně, pronikají v závislosti na čase do jejího okolí. Rychlost pronikání iontů je však významně ovlivněna i vlhkostí vzdu­chu a charakterem podložního materiálu. Princip průkazu spočívá v převedení iontů chloru na chlorid stříbrný s následnou redukcí na amorfní stříbro, které lemuje v různé šíři zkoumanou krevní skvrnu. Podle šíře lemu vyredukovaného stříbra lze s velkou opatrností usuzovat na dobu vzniku krevní skvrny. Vždy je třeba vzít v úvahu i podmínky, ve kterých byla krevní skvrna nalezena.

• Spektrofotometrie - stárnutí krevní skvrny se díky přeměnám krevní­ho barviva projevuje i změnami absorpčního spektra v oblasti viditelného světla. Nejvhodnější se jeví změny poměrů absorpčního maxima při 578 nm a 560 nm. Poměry absorpčních maxim uvedených vlnových délek vykazují v závislosti na čase postupný pokles, který je nejzřetelnější a pro hodnocení nejpříznivější zejmé­na zpočátku, asi do 1 měsíce stáří krevní skvrny. Na rozdíl od chloridového testu nejsou výsledky ovlivněny vlhkostí prostředí, ale spíše teplotou, ke které je vhod­né při konečném odhadu stáří krevní skvrny přihlédnout.

1.10. Určení množství krve