Provoz na pracovištích patologie

In situ hybridizace (ISH)

In situ hybridizace je metoda, při které jsou geny a jejich změny detekovány pomocí komplementárních úseků DNA (= proby), na které je navázána specifická značka. Značka může být fluorescenční (fluorochrom = fluorescenční in situ hybridizace, FISH), chromogenní (chromogenní in situ hybridizace, CISH) a nebo může jít o kombinaci chromogenu a stříbra (= silver/dual in situ hybridizace, SISH/DISH).
Detekovány mohou být kvalitativní změny (delece, translokace) i změny kvantitativní (amplifikace).
Tato metoda je aplikovatelná na tkáňové řezy z parafínových bloků (materiál FFPE), řezy ze zmražených tkání i cytologický materiál.
Výhodou in situ hybridizace je kombinace molekulárního přístupu (detekce genových změn) a histologie (lokalizace ve tkáních), a to především u CISH a SISH/DISH metody. Hlavní výhodou FISH metody je možnost detekce translokačních signálů – splynutím dvou různých barevných signálů (zelená a červená) dochází k vytvoření směsného signálu jiné barvy (žlutá/oranžová).   
Obecnou nevýhodou in situ hybridizačních vyšetření je vyšší citlivost na správnou fixaci tkáně. Specifickou nevýhodou FISH metody je nutnost práce v tmavých prostorech (zamezení „vysvícení“ signálů) a postupné blednutí signálů.   
Cena in situ hybridizačního vyšetření je obecně vyšší než u imuno metod.

Obecný postup
natrávení
denaturace
aplikace proby
hybridizace
detekce  

Natrávení
Pomocí enzymů je odtrávena přebytečná tkáň.

Denaturace
Teplem (varem) se od sebe rozdělí dvojšroubovice DNA, na dvě jednotlivá vlákna.

Aplikace próby a hybridizace
Proba (komplementární úsek NK) označená značkou je aplikována a navázána.

Detekce
Detekce se děje odlišně podle použité metody – FISH a SISH přímá detekce (fluorescenční, světelný mikroskop), u CISH metody následuje imuno reakce.  

CISH
Chromogenní in situ hybridizace (CISH) je metoda, při které je proba značená chromogenem. Mohou být použity jeden nebo dva chromogeny. Výsledek je hodnocen ve světelném mikroskopu. Hodnotí se přítomnost genu nebo jeho chybění (delece).
Příklady: EBER (detekce nukleové kyseliny viru Epstein-Barrové), kappa/lambda (detekce lehkých řetězců), del 1p19q (specifická delece oligodendrogliálních nádorů).

FISH (snímek 70.-71.)
Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) je metoda, při které je proba značená fluorochromem. Mohou být použity jeden nebo dva chromogeny. Výsledek je hodnocen ve fluorescenčním mikroskopu. Výhodou je možnost detekce směsných (genové translokace) a nebo naopak rozkladných signálů (break-apart sondy, detekce typických genových zlomů). Nevýhodou je blednutí a tím pádem nestálost (nízká životnost) preparátů.
Příklady: ALK (plicní karcinomy), hematologická onemocnění (c-myc, bcl2, bcl6…).

SISH/DISH
Silver in situ hybridizace (SISH), nebo také dual in situ hybridizace (DISH) je metoda, při které se kombinuje chromogenní a stříbrná koncovka.
Používá se pro hodnocení HER2. Toto hodnocení je kvantifikační – kvantifikuje se počet signálů!)