Rozlišení

Rozlišení je definováno jako nejmenší vzdálenost dvou bodů, kdy jsou ještě zobrazeny jako dva body - rozlišovací mez. Rozlišení je omezeno vlnovou povahou světla t.j. difrakcí. Pozorovaný objekt si pro odvození vztahu mezi rozlišením a vlnovou délkou použitého světla můžeme představit jako mřížku s mřížkovou konstantou δ, na kterou dopadá kolmo svazek rovnoběžných paprsků:

M03

Po průchodu světla mřížkou dochází k difrakci a vznikají interferenční maxima a minima. Pokud pozorujeme mřížku mikroskopem, musí se do objektivu dostat nejméně maxima nultého a prvního řádu, mohl vzniknout obraz mřížky. Pokud by se do objektivu dostalo jen maximum nultého řádu, obrazem byla rovnoměrně osvětlená plocha. Paprsky nultého a prvního maxima jsou dráhově posunuty o x = δsinα. Podmínku pro vznik maxima pak můžeme vyjádřit jako δsinα = kλ. Při průchodu světla optickým prostředím se jeho frekvence nemění: f = v/λ. Absolutní index lomu prostředí je n =c/v. Pro vztah mezi vlnovou délkou světla ve vakuu a v prostředí s indexem lomu n je tedy λ = λ0/n. Po dosazení do podmínky pro vznik maxima dostaneme δ = kλ0/nsinα. Pro první maximum je k = 1:

\delta = \frac{{\lambda _0 }}{{n\sin \alpha }} = \frac{{\lambda _0 }}{{NA}}

δ odpovídá rozlišení mikroskopu, NA je numerická apertura.

M04

V klasické mikroskopii mikroskopii se standardně používá světlo v plném rozsahu viditelného spektra. Proto pro účely stanovení rozlišení (viz následující kapitola) pracujeme nejčastěji s vlnovou délkou v oblasti největší citlivosti lidského oka, přibližně 550 nm. V případě snímání pomocí kamer či speciálních fotosenzorů, použití monochromatického zdroje světla - např. v laserové konfokální mikroskopii či fluorescenční mikroskopii, pracujeme s konkrétní vlnovou délkou (či úzkým rozsahem vlnových délek) světla vstupujícího do objektivu. Z těchto důvodů je vhodné znát i vztah mezi energií E [J], intenzitou I [W·m-2] a vlnovou délkou λ použitého světla. 

E = h·\frac{{c}}{{\lambda}}

kde h je Planckova konstanta 6,62607015×10−34 J⋅s

I = \frac{{E}}{{t·S}}

kde t je čas pozorování a S plocha (senzoru).