Buněčná migrace

1. Úvod

Pohyb je jednou ze základních charakteristik života. Uvnitř buněk se stále něco pohybuje a také celé buňky, případně celé mnohobuněčné organismy, využívají pohyb k zajištění životních funkcí. Schopnost pohybu je nutná pro získávání potravy, pro únik před predátory a nebezpečnými vlivy prostředí i pro zajištění pohlavního rozmnožování. U mnohobuněčných organismů má pohyb buněk zásadní úlohu při vývoji tkání a orgánů, hojení ran nebo imunologické odpovědi.

Schopnost pohybu se vyskytuje napříč všemi říšemi – pohybují se bakterie, archaea i eukaryota. Během evoluce došlo k vývoji různých mechanismů pohybu v závislosti na mechanických vlastnostech buněk a jejich interakci s konkrétním prostředím. Bakterie používají bakteriální bičíky a pili, archea zvláštní bičíky zvané archaella, eukaryontní buňky využívají různé struktury založené na komponentách eukaryontního cytoskeletu.

V souvislosti s buněčnými pohyby se můžeme setkat s různými odbornými názvy.  Nejobecnějším pojmem je buněčná motilita,  zahrnující buněčné pohyby v nejširším slova smyslu, tj. pohyby struktur uvnitř buněk i pohyby celých buněk. Termín buněčná lokomoce se vztahuje k různým typům pohybů celých buněk, ať už za pomoci řasinek, bičíků nebo dalších způsobů pohybu. V rámci buněčné lokomoce existuje ještě pojem buněčná migrace, který je obvykle vyhrazen pro mezenchymální a améboidní pohyb eukaryontních buněk nebo jejich skupin v rámci mnohobuněčných organismů.

V tomto kurzu se nebudeme zabývat intracelulárními pohyby, ani pohyby bakterií a archaeí, ale soustředíme se na pohybové strategie eukaryontních buněk, a to hlavně buněk lidských. Kurz předpokládá základní znalost struktury a funkce eukaryontních buněk, zejména pak vědomosti o cytoskeletu. Využijete také znalosti o buněčné signalizaci (viz. samostatný e-learningový kurz) a o kultivaci buněk in vitro (které je věnováno praktické cvičení v rámci prvního semestru).

2. Základní mechanismy pohybu eukaryotických buněk

Eukaryontní buňky používají ke svému pohybu několik typů membránových výběžků, obsahujících více nebo méně dynamické uspořádání cytoskeletálních vláken. Mechanismus pohybu je založen na  třech klíčových schopnostech cytoskeletální soustavy: 1) koordinovaně polymerovat a depolymerovat vlákna, 2) regulovat architekturu vláken pomocí asociovaných proteinů a 3) interagovat s motorovými proteiny. Přestože jedna ze složek cytoskeletu může v určitém typu pohybu působit jako dominantní,  pohyb vyžaduje vždy koordinované působení všech tří typů cytoskeletálních vláken – mikrotubulů, mikrofilament i intermediárních filament. Významnou úlohu v pohybu má také plazmatická membrána a extracelulární matrix obklopující pohybující se buňky. Receptory v plazmatické membráně buňky zprostředkují informace o chemických a mechanických signálech, které vyplývají z povahy okolního prostředí. Mezibuněčné spoje mohou zajistit koordinovaný pohyb celých skupin buněk. Tak jako u běžícího člověka je do pohybu zapojeno celé tělo, tak se u buňky zapojují do pohybu nebo alespoň přizpůsobují pohybu všechny její kompartmenty.

Eukaryontní buňky se mohou pohybovat samostatně nebo ve skupinách. Pro pohyb z bodu A do bodu B mohou využít několik mechanismů, které by se daly zjednodušeně označit jako plavání, mezenchymální pohyb a améboidní pohyb. V následujících odstavcích popíšeme jednotlivé typy pohybu podrobněji.

3. Plavání pomocí řasinek a bičíků

Za pomoci řasinek a bičíků se může buňka aktivně pohybovat v tekutém prostředí, bez kontaktu s pevným substrátem (Obr. 1). Pomocí řasinek mohou buňky plavat v tekutině (jako například prvok Paramecium sp.), nebo mohou naopak pohybovat tekutinou kolem sebe, tak jako to činí řasinkové epitely v našem těle (připomeňte si z histologie, jak rozmanité mohou být řasinky na buňkách lidských tkání a že ne všechny jsou pohyblivé). Bičíkový pohyb využívá mnoho prvoků,  z lidských buněk se takto pohybují pouze spermie.

Obr 1. Bičíky a řasinky. A) Vlnění bičíku umožňuje spermiím plavat v tekutém prostředí. B) Řada prvoků používá ke svému pohybu řasinky umístěné na povrchu buňky. C)  Řasinkové epitely pomocí řasinek pohybují tekutinou a objekty ve svém okolí. D) Pohyb řasinky. Vlevo záběr, vpravo návrat do původní polohy.

Řasinky a bičíky jsou vláskovité struktury pokryté plazmatickou membránou. Uvnitř bičíků a pohyblivých řasinek se nachází charakteristické uspořádání mikrotubulů zvané „9 + 2“ (Obr. 2A). Jedna centrální dvojice a devět vnějších dvojic mikrotubulů jsou navzájem propojeny řadou dalších proteinů. Na každé dvojici vnějších mikrotubulů jsou napojeny motorové proteiny dyneiny. Když dojde k hydrolýze ATP spojeného s hlavičkou dyneinu, hlavička se naváže na sousední dvojici mikrotubulů a pokusí se s ní pohnout. Protože jsou dvojice mikrotubulů spojeny proteinovými spojkami, nemohou se vůči sobě posunout a dochází k ohýbání celé struktury, což způsobuje vlnění bičíku nebo řasinky (Obr. 2B).

Obr. 2   A) „9 + 2“ uspořádání mikrotubulů v bičíku. B) Ohýbání svazků mikrotubulů, způsobené aktivací motorových proteinů dyneinů.

Báze bičíku nebo řasinky je tvořena bazálním tělískem To se skládá z devíti trojic mikrotubulů a řady dalších proteinů a svou strukturou odpovídá centriole. Slouží jako nukleační centrum mikrotubulů bičíku nebo řasinky (Obr. 3).

Obr. 3  Bazální tělísko. A) Mikrotubuly bičíku nebo řasinky vyrůstají z bazálního tělíska (zeleně), které slouží jako jejich organizační centrum. B) Příčný řez bazálním tělískem, znázorňující charakteristické uspořádání devíti trojic mikrotubulů.

4. Mezenchymální pohyb

Tento typ buněčné migrace byl studován zejména na fibroblastech a dalších typech normálních i nádorových buněk in vitro.  Často se označuje jako „plazení“ („cell crawling“) a je to dosud nejdůkladněji prozkoumaný způsob buněčné migrace.

Na podkladu kultivačních nádob se buňky rozprostřou a získají výraznou předo-zadní polaritu (Obr. 4).  Na předním konci buňky, zvaném vedoucí konec, se vytvoří široké výběžky plazmatické membrány zvané lamelipodia spolu s úzkými dlouhými výběžky zvanými filopodia. Lamelipodia i filopodia vznikají polymerací aktinových vláken ve směru pohybu buňky. V lamelipodiích jsou tato vlákna uspořádána do silně rozvětvené sítě, ve filopodiích tvoří rovnoběžné svazky. Lamelipodia a filopodia jsou průzkumné struktury, kterými buňka ohledává terén ve směru pohybu. Jsou velmi dynamické, rychle vznikají a zase zanikají, vedoucí konec plazící se buňky se tak neustále vlní a přelévá (v angličtině se tomu říká „ruffling“). Na spodní straně lamelipodia se tvoří tzv. fokální adheze – body zakotvení, kterými buňka adheruje poměrně pevně k povrchu, po kterém se plazí. Fokální adheze obsahují transmembránové adhezní proteiny integriny a mnoho dalších proteinů. Jejich úkolem je propojit aktinová vlákna v buněčné cytoplazmě s vlákny extracelulární matrix (ECM) a tak pevně přichytit buňku k podkladu. Aktinová vlákna zakotvená ve fokálních adhezích jsou uspořádána do rovnoběžných svazků zvaných stresová vlákna, obsahujících kromě dalších proteinů také nesvalový myosin II. Jsou kontraktilní a fungují jako buněčné svaly – jejich kontrakcí buňka přitahuje svůj zadní konec (Obr. 5).

Obr. 4   Plazení fibroblastu po pevném podkladu. A) Schematické znázornění hlavních struktur plazící se buňky. B) Lidský fibroblast v kultuře in vitro, imunofluorescěnční barvení aktinových vláken (oranžově) a proteinu parvinu (zeleně). Parvin je součástí fokálních adhezí.

Obr. 5  Uspořádání aktinu v plazící se buňce.

Plazení fibroblastu je cyklický děj, sestávající z několika kroků: extenze, adheze, kontrakce a  retrakce. Buňka adheruje k podkladu pomocí fokálních adhezí, vedoucí konec buňky je protažený ve směru pohybu (Obr. 6A).  Ve fázi extenze dojde k polymeraci aktinových vláken ve směru pohybu a tím k prodloužení lamelipodií a filopodiií (Obr. 6B). Na spodní straně nově vytvořených výběžků vzniknou nové fokální adheze (Obr. 6C).  Následuje kontrakce a retrakce - dojde ke stahu stresových vláken, buňka přitáhne zadní konec a přesune těžiště dopředu. Zároveň musí dojít k rozpadu fokálních adhezí na zadním konci buňky (Obr. 6D). Buňka se posunula dopředu, cyklus se může opakovat (Obr. 6E).

Obr. 6  Plazení fibroblastu jako cyklický pohyb.

Výše popsaný pohyb buňky po povrchu kultivační nádoby neodpovídá zcela skutečné situaci in vivo.  Za některých okolností mohou i buňky in vivo migrovat po 2D povrchu, například epitelové buňky po povrchu bazální membrány během organogeneze, nebo buňky imunitního systému po stěnách cév. Většina pohybů se však děje ve 3D uspořádání, kdy je migrující buňka ze všech stran obklopena  ostatními buňkami nebo extracelulární matrix (ECM). Buňky si tak musejí buď najít nebo vytvořit cestu skrz stěny cév, pojivové tkáně nebo epitely. Konkrétní způsob pohybu je ovlivněn vlastnostmi prostředí – typem a hustotou vláken ECM, jejich tuhostí a vzájemnou orientací. Na straně buněk záleží zejména na  síle adheze buňky k podkladu a také na mechanické odolnosti buněčného jádra. Buňky imunitního systému (např. dendritické buňky) mají měkká, snadno deformovatelná jádra a adherují k ECM poměrně slabě, což jim umožňuje rychle se pohybovat mezi vlákny. Fibroblasty se pohybují pomaleji, mají tužší jádra a během pohybu adherují silněji k vláknům ECM. Protáhnout objemné buněčné jádro prostory mezi buňkami je však problém společný všem typům buněk a všem druhům pohybu. Buňky v tom, podobně jako v případě 2D pohybu,  spoléhají na kontraktilní aktino – myosinová vlákna.

Pro mezenchymální pohyb ve 3D prostředí je charakteristickým znakem degradace ECM. Ve srovnání s plazením po pevném 2D povrchu nejsou buňky tak ploché a rozprostřené, mají spíše vřetenovitý tvar.  Také  lamelipodia jsou mnohem menší.  Buňky mají jasně rozlišitelný přední a zadní konec,  obsahují stresová vlákna, síly potřebné k pohybu generují podobným způsobem jako při 2D migraci. Během pohybu dochází k tvorbě fokálních adhezí obsahujících integriny a pohyb je v důsledku toho relativně pomalý, přibližně 0,1 – 1 µm/min.  Buňky také tvoří zvláštní výběžky nazývané u normálních buněk podosomy, u nádorových buněk invadopodia.  Tyto výběžky obsahují aktinová vlákna, další strukturní a signální proteiny a množství váčků. Nacházejí se v místech kontaktu buňky s ECM ve směru pohybu a jejich úkolem je vylučovat proteolytické enzymy, zejména matrixové metaloproteinázy (MMP).  Migrující buňky tak před sebou rozpouštějí ECM a vytvářejí si v ní průchod (Obr. 7).

Obr. 7  A) Invaze buňky do ECM pomocí invadopodií, B) migrace buňky v ECM. Červeně je znázorněno vylučování proteolytických enzymů, degradujících ECM. C) Mezenchymální způsob migrace. Buňka adheruje k vláknům ECM pomocí fokálních adhezí obsahujících integriny. Za sebou nechává tunel vzniklý proteolytickou degradací ECM.

5. Améboidní pohyb

Jak název naznačuje, buňky pohybující se tímto způsobem připomínají prvoka amébu (Obr. 8).  Mají spíše zaoblený tvar, který jsou schopné rychle měnit. Adheze k podkladu je velmi slabá, pohyb je tedy mnohem rychlejší než v případě mezenchymálního pohybu (až 20 µm/min) a buňka snadněji mění směr. Buňka má sice určitou polaritu, může však pružně měnit pozici svého „předního konce“ a tak rychle střídat směr pohybu. Klasickým příkladem buněk využívajících améboidní pohyb jsou leukocyty a makrofágy. Při pohybu ve 3D prostředí nedochází při améboidním pohybu k vylučování proteolytických enzymů, buňky místo toho hledají cestu mezi vlákny ECM a ostatními buňkami a protahují se mezi nimi. Používají přitom buněčné jádro podobně, jako kočka své hmatové vousy – umístí ho spíše v přední části buňky a zkoušejí, kudy jej lze protáhnout, aniž by se poškodilo.

Obr. 8  Améboidní způsob pohybu. Buňky neadherují pevně k vláknům ECM a také ji nerozpouštějí, ale spíše se mezi vlákny protahují.

Při améboidním pohybu nevytvářejí buňky filopodia ani lamelipodia, místo nich vznikají na předním konci buňky zaoblené výběžky zvané bleby (Obr. 9). V místě blebu se plazmatická membrána odpojí od aktinového kortexu (ke kterému je jinak zakotvena). Pod tlakem buněčného obsahu se bleb začne zvětšovat a postupně se na spodní straně plazmatické membrány uvnitř blebu začne formovat nový kortikální aktin schopný kontrakce. Po jeho smrštění dojde k zatažení blebu zpátky do buňky a obnovení buněčného kortexu.  Tlak potřebný k odpojení membrány od kortexu a k nahnání cytoplazmy do blebů v přední části buňky je generován kontrakcemi aktino-myosinových komplexů. Pohyb se tedy děje koordinovaným vytvářením blebů v přední části buňky a prouděním cytoplazmy vyvolaným kontrakcemi. Buňka může velmi rychle přesunovat oblast blebů po celém svém povrchu a tak měnit směr pohybu. (Podobný mechanismus se uplatňuje také při tvorbě membránových blebů během dělení buněk nebo během apoptózy.)

Obr. 9  Mechanismus améboidního pohybu.

6. Signalizace během buněčné migrace

Buněčná migrace během morfogeneze, při hojení ran a v rámci funkcí imunitního systému vyžaduje časovou a prostorovou organizaci. Buňky jsou směrovány do svých cílových struktur a kompartmentů s velkou přesností. Nejznámějším „naváděcím mechanismem“ je chemotaxe – pohyb buněk ve směru gradientu určité rozpustné molekuly. Chemotakticky působí například růstové faktory, chemokiny a cytokiny, často i ve vzájemných složitějších kombinacích.  Podobným mechanismem je haptotaxe, při které jsou buňky přitahovány gradientem molekul vázaných na pevný substrát, například molekul na povrchu jiných buněk nebo složek ECM. Existuje i durotaxe, kdy buňky směřují k místům s vyšší tuhostí substrátu, nebo elektrotaxe, pohyb vyvolaný elektrickým polem.

Buněčná migrace vyžaduje komunikaci všech buněčných komponent. Buňky neustále přijímají signály z okolí, koordinují změny tvaru a udržují předo-zadní polaritu. Chemické signály (chemoatraktanty) působí na buňky prostřednictvím receptorů spojených s G-proteiny (GPCR), růstové faktory vazbou na receptorové tyrozin-kinázy (RTK). Buňky také vyhodnocují míru buněčné adheze prostřednictvím integrinů, kadherinů a dalších molekul buněčných spojů. Informace z okolí buňky zprostředkované různými typy receptorů jsou v buňce směrovány  na skupinu signálních proteinů zvaných Rho-GTPázy, které jsou zodpovědné za globální přestavby cytoskeletu.  Jedná se o rodinu monomerních G-proteinů, patřících do proteinové nadrodiny Ras (připomeňte si, že G-protein je aktivován vazbou s GTP a v té chvíli je schopen aktivovat dalšího člena signální dráhy, naopak hydrolýza GTP na GDP přepne G-protein do stavu „vypnuto“).  Tři nejlépe prostudované Rho – GTPázy jsou Rac1, Cdc42 a RhoA. V případě mezenchymálního pohybu se Rac1 a Cdc42 nacházejí na vedoucím okraji buňky, kde jsou zodpovědné za polymeraci aktinu, tvorbu výběžků a udržování buněčné polarity. RhoA se nachází v zadní části buňky, kde podporuje tvorbu stresových vláken a jejich kontraktilitu (Obr. 7). V případě améboidního pohybu dochází k potlačení aktivity Rac a buňce dominuje aktivita Rho posilující kontraktilitu buňky.

Rho-GTPázy se také (spolu s řadou dalších signálních molekul) účastní koordinace pohybu s dalšími buněčnými strukturami - s mikrotubuly, intermediárními filamenty a příslušnými asociovanými proteiny, s buněčnými organelami a s plazmatickou membránou.

Obr. 7  Úloha Rho-GTPáz v buněčné migraci. GPCR – receptory spojené s G-proteiny. RTK – receptorové tyrozinkinázy.  A) Hlavní účinky aktivace jednotlivých Rho-GTPáz. B) Rozložení působnosti jednotlivých Rho-GTPáz při mezenchymálním pohybu C) Dominance Rho při améboidním pohybu.

Ze srovnání mezenchymální a améboidní migrace vyplývá, že oba způsoby pohybu využívají schopnosti aktinového cytoskeletu polymerovat a depolymerovat vlákna a vytvářet kontraktilní svazky, každý však trochu jiným způsobem. Buňky také umějí mezi různými typy pohybu přepínat – např.  pro fibroblast je typická mezenchymální pohyblivost, pro leukocyty améboidní, ale oba typy buněk zvládnou používat i opačný způsob pohybu (a zřejmě i některé další způsoby, nezmiňované v tomto materiálu). Velká plasticita pohybu existuje bohužel i u nádorových buněk.

7. Kolektivní migrace

Jednotlivé buňky mohou migrovat za sebou průchodem ve tkáni a vytvářet tak proud buněk (Obr. 12 A). O kolektivní migraci však hovoříme teprve ve chvíli, kdy se celé skupiny buněk koordinovaně pohybují určitým směrem a udržují mezi sebou více nebo méně pevná spojení.  

Kolektivní migrace se uplatňuje při tak významných procesech jako je gastrulace, migrace buněk neurální lišty nebo uzavírání ran. Podobně jako při migraci jednotlivých buněk musí i skupina buněk interagovat s ECM a ostatními buňkami. Navíc musí koordinovat pohyb jednotlivých členů skupiny a udržovat mezibuněčné spoje. Způsoby kolektivní migrace se liší právě v síle a způsobech vzájemné adheze buněk a v podílu jednotlivých buněk na celkové motilitě skupiny.

Pokud je třeba uvést do pohybu skupinu pevně spojených epitelových buněk, buňky na okraji skupiny převezmou roli „tahounů“ – stanou se z nich tzv. vedoucí buňky (Obr. 12B). Díky procesu nazývanému epitelově-mezenchymální tranzice (EMT) získají charakteristické vlastnosti mezenchymálních buněk – předozadní polaritu a schopnost pohybu. Ostatní buňky k nim zůstanou připojeny pomocí adhezních spojů obsahujících E-kadheriny. Vedoucí buňky generují síly potřebné k pohybu, ostatní buňky jsou vlečeny za nimi. Tato kolektivní migrace představuje nejpomalejší způsob buněčného pohybu, dosahuje rychlostí kolem 0.01 – 0.05 µm/min. Kromě mezenchymálního pohybu mohou vedoucí buňky také použít souvislý kontraktilní pruh složený z aktinu a myosinu, který vytvoří pod plazmatickou membránou a který je propojí navzájem (Obr. 12C). Koordinovaným stažením tohoto pruhu dojde k pohybu skupiny buněk, asi jako když šňůrkou zatahujeme váček.  Tento typ migrace se zvláště uplatňuje při hojení ran.

Od epitelu se může také odloučit skupina buněk, které prošly EMT a migrují jako volně spojená skupina (Obr. 12D). Každá buňka generuje trakční síly sama, skupina je však volně propojena různými typy mezibuněčných spojů.

 Obr. 12  A) proud jednotlivých migrujících buněk. B)  Kolektivní migrace buněk pevně spojených mezibuněčnými spoji. C) Zatahování rány pomocí kontraktilníhom pruhu probíhajícího vedoucími buňkami D)  Kolektivní migrace volně spojených buněk.

8. Buněčná migrace v patologii onemocnění

Poruchy buněčné motility jsou příčinou řady patologických stavů. Tyto poruchy jsou způsobeny mutacemi v genech pro jednotlivé složky cytoskeletu včetně asociovaných a motorových proteinů, i mutacemi v proteinech buněčných adhezí, případně signálních drah koordinujících motilitu. Poškozené buňky vykazují typicky poruchy vnitrobuněčné motility i celkové buněčné lokomoce. Jedná se o velmi různorodou skupinu onemocnění, na tomto místě zmíníme jen velmi stručně některé příklady takových poruch.

Mužská infertilita. Defekty ve struktuře a funkci  mikrotubulů v bičíku spermií způsobují sníženou pohyblivost, případně úplnou nepohyblivost spermií  a tím mužskou infertilitu. Jedním z příkladů takové poruchy je primární ciliární dyskineze (PCD), vzácné autozomálně recesivní onemocnění,  charakterizované úplnou nebo částečnou nepohyblivostí řasinek a bičíků. Projevuje se zhoršením samočistící funkce epitelů dýchacích cest s následnými rekurentními infekcemi a z nich vyplývajícím trvalým poškozením tkání, infertilitou a v řadě případů také stavem situs viscerum inversus (zrcadlově obrácené uložení nepárových orgánů).  Dosud bylo posáno kolem 30 genů, jejichž mutace způsobují PCD, většina z nich ovlivňuje funkce dyneinových ramen, příčných proteinových spojek a počet i uspořádání mikrotubulových dubletů v bičíku.

Imunodeficience. Mutace v genech regulujících strukturu a funkci aktinového cytoskeletu jsou příčinou vrozených poruch imunity. Klasickým příkladem takové poruchy je Wiskott – Aldrichův syndrom (WAS). Jedná se o X-vázané recesivní onemocnění, způsobené mutacemi v genu pro protein WASP, multifunkční protein nezbytný pro správnou nukleaci a polymeraci aktinových vláken (a tím např. pro vznik imunologické synapse u T – lymfocytů nebo pro tvorbu krevních destiček). Charakteristickými projevy WAS jsou trombocytopenie, rekurentní respirační infekce, krvácivé projevy, zvýšený výskyt autoimunních onemocnění a malignit.

Vrozené vývojové vady. Buněčná migrace je nezbytná pro správný vývoj tkání a orgánů během embryonálního a fetálního vývoje. Defekty v buněčné migraci neuronů jsou příčinou více než 25 syndromů spojených s vrozenými malformacemi mozku. Jako příklad uvádíme Miller-Diekerův syndrom, způsobený mutací v genu LIS1, který kóduje protein účastnící se organizace mikrotubulů v migrujících neuronech a směrování této migrace. Poruchy buněčné migrace mají za následek i malformace skeletu, srdeční vady, poruchy vaskularizace, pigmentace, střevní pohyblivosti a další.

Nádorová onemocnění. Charakteristickou vlastností maligních nádorů je jejich schopnost šířit se organismem z primárního ložiska a zakládat ložiska  vzdálená – metastázy. Nádorové buňky přitom využívají všech způsobů pohybu, které jsme popsali v předchozích oddílech. Zneužívají tak programy, které slouží organismu k vykonávání normálních, fyziologických typů pohybu. Navíc mívají nádorové buňky schopnost přepínat mezi různými typy pohybů – pružně přecházet mezi mezenchymálním a améboidním pohybem, mezi kolektivní migrací a migrací jednotlivých buněk. Tato skutečnost má závažné důsledky i pro vývoj terapií zaměřených na buněčnou invazivitu a metastazování. Pokud se například pokusíme nádorové,  mezenchymálně migrující buňky zastavit tím, že inhibujeme produkci proteolytických enzymů, buňky přepnou na améboidní způsob, který proteolýzu nepotřebuje. Podrobnosti o vlastnostech nádorových buněk a procesu metastazování se dozvíte v přednášce zaměřené na biologii nádorů, ve druhém semestru lékařské biologie.

9. Způsoby měření buněčné migrace

Buněčná migrace je předmětem intenzivního výzkumu. Jeho cílem je pochopit fyziologické principy migrace i způsoby jejich zneužívání nádorovými buňkami. Migrační testy se také využívají při vývoji léčiv. Buňky lze v laboratoři uvést do pohybu různými metodami, existují i sofistikované systémy pro pozorování buněk migrujících v pokusných organismech  in vivo („in vivo live imaging“).

Klasickou metodou měření buněčné migrace in vitro ve 2D uspořádání je tzv. „scratch assay“, nazývaná také „wound healing assay“, neboli zacelování rány (Obr. 13). Buňky se kultivují v Petriho misce nebo jamce kultivační destičky až do dosažení nejméně 95% konfluence, aby vytvořily souvislou vrstvu. V této vrstvě uděláme špičkou pipety „ránu“ – seškrábneme buňky tak, aby vznikl prázdný pruh. Buňky umístíme do zobrazovacího zařízení a pomocí časosběrné mikroskopie sledujeme vcestování buněk do uvolněného prostoru a zacelování „rány“.  Alternativním postupem je nasazení buněk do předem připraveného rámečku, po jehož odstranění zůstane mezi buňkami definovaná mezera. Tento postup se nazývá „gap closure assay“ (uzavírání mezery) - a má mnoho variant – mezera může být obdélníková nebo kruhová či jiných tvarů a lze ji vytvořit pomocí několika různých postupů.  Popsané metody jsou vhodné hlavně pro sledování kolektivní migrace epitelových buněk, případně pro pozorování mezenchymální migrace jednotlivých buněk na okraji rány. Pomocí softwaru pro obrazovou analýzu lze potom kvantifikovat velikost uzavřené plochy a odhadnout rychlost migrace, případně změřit rychlost pohybu jednotlivých buněk (Obr. 14) .

Obr. 13  Test „zacelování rány“ (wound healing assay). A) Přerušení vrstvy buněk špičkou pipety. B) Vpravo – postup zacelování mezery migrací buněk. (Fotografie: https://ibidi.com/content/280-principle-wound-healing-and-migration)

Obr. 14  Počítačový program umožňuje sledovat a kvantifikovat dráhu jednotlivých buněk. Zdroj: https://ibidi.com/content/232-chemotaxis.

 Druhou velmi často používanou metodou je tzv, „transwell assay“ (Obr. 15). Prostor, ve kterém buňky migrují, sestává ze dvou komůrek umístěných svisle nad sebou, dno horní komůrky je tvořeno membránou s definovanými póry. Do horní komůrky se nasazují buňky, dolní obsahuje chemoatraktant, ke kterému jsou buňky přitahovány a v důsledku toho migrují skrze póry z horní komůrky do dolní. Počet buněk v dolní komůrce lze potom různými způsoby kvantifikovat.

Obr. 15 Princip „transwell assay“.

Jako poslední zmíníme mikroskopické komůrky pro chemotaxi (Obr. 16). Jsou to zvláštní podložní skla obsahující prostor pro buňky obklopený ze dvou stran komůrkami pro aplikaci média a roztoků. Tyto komůrky kombinují výhody obou předchozích metod. Podobně jako v případě „transwell assay“ migrují  buňky směrem k chemoatraktantu, tentokrát však vodorovně  a my máme možnost zachytit je ve skutečném čase na časosběrném záznamu.

Obr. 16 Mikroskopické komůrky pro chemotaxi dodávané firmou Ibidi. A) Sklíčko obsahuje tři migrační komůrky. Prostřední oddíl každé komůrky je určen pro buňky, dva trojúhelníkové prostory po stranách slouží k vytvoření gradientu chemoatraktantu. Buňky jsou snímány zespodu pomocí časosběrné mikroskopie. B) Buňky migrují směrem k chemoatraktantu, migrační dráhy jednotlivých buněk lze kvantifikovat pomocí softwarového nástroje. Zdroj: https://ibidi.com/content/232-chemotaxis.

Všechny popsané metody lze uzpůsobit také pro analýzu buněk ve 3D podmínkách. Buňky se v tomto případě nechávají migrovat v uměle připraveném gelu. Gel může být jednoduchý a obsahovat např. jen kolagen, nebo se může jednat o složitější kombinace molekul napodobující komplexní uspořádání ECM. Gel může dokonce obsahovat i různé typy dalších buněk, podobně jako je tomu in vivo u normálních a nádorových tkání. Takto modifikovaná metoda potom poskytuje výsledky lépe odpovídající skutečné situaci v organismu.

10. Zdroje

Alberts B. a kol.: Molecular Biology of the Cell, 5. vydání, 2008, Garland Science, USA

Yamada K.M. et al.: Mechanisms of 3D cell migration. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019. PMID: 31582855 Review.

Pandya P. et al.: Modes of invasion during tumour dissemination. Mol Oncol. 2017 Jan;11(1):5-27.

Petrie RJ, Yamada KM.: Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility. Trends Cell Biol. 2015 Nov;25(11):666-674

Friedl P, Mayor R :Tuning Collective Cell Migration by Cell-Cell Junction Regulation. . Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017

Murphy DA, Courtneidge SA. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011;12(7):413-426.

Pijuan J, Barceló C, Moreno DF, et al. In vitro Cell Migration, Invasion, and Adhesion Assays: From Cell Imaging to Data Analysis. Front Cell Dev Biol. 2019;7:107. Published 2019 Jun 14.

https://ibidi.com/