Buněčná migrace

9. Způsoby měření buněčné migrace

Buněčná migrace je předmětem intenzivního výzkumu. Jeho cílem je pochopit fyziologické principy migrace i způsoby jejich zneužívání nádorovými buňkami. Migrační testy se také využívají při vývoji léčiv. Buňky lze v laboratoři uvést do pohybu různými metodami, existují i sofistikované systémy pro pozorování buněk migrujících v pokusných organismech  in vivo („in vivo live imaging“).

Klasickou metodou měření buněčné migrace in vitro ve 2D uspořádání je tzv. „scratch assay“, nazývaná také „wound healing assay“, neboli zacelování rány (Obr. 13). Buňky se kultivují v Petriho misce nebo jamce kultivační destičky až do dosažení nejméně 95% konfluence, aby vytvořily souvislou vrstvu. V této vrstvě uděláme špičkou pipety „ránu“ – seškrábneme buňky tak, aby vznikl prázdný pruh. Buňky umístíme do zobrazovacího zařízení a pomocí časosběrné mikroskopie sledujeme vcestování buněk do uvolněného prostoru a zacelování „rány“.  Alternativním postupem je nasazení buněk do předem připraveného rámečku, po jehož odstranění zůstane mezi buňkami definovaná mezera. Tento postup se nazývá „gap closure assay“ (uzavírání mezery) - a má mnoho variant – mezera může být obdélníková nebo kruhová či jiných tvarů a lze ji vytvořit pomocí několika různých postupů.  Popsané metody jsou vhodné hlavně pro sledování kolektivní migrace epitelových buněk, případně pro pozorování mezenchymální migrace jednotlivých buněk na okraji rány. Pomocí softwaru pro obrazovou analýzu lze potom kvantifikovat velikost uzavřené plochy a odhadnout rychlost migrace, případně změřit rychlost pohybu jednotlivých buněk (Obr. 14) .

 

Obr. 13  Test „zacelování rány“ (wound healing assay). A) Přerušení vrstvy buněk špičkou pipety. B) Vpravo – postup zacelování mezery migrací buněk. (Fotografie: https://ibidi.com/content/280-principle-wound-healing-and-migration)

 

 

 

Obr. 14  Počítačový program umožňuje sledovat a kvantifikovat dráhu jednotlivých buněk. Zdroj: https://ibidi.com/content/232-chemotaxis.

 

 Druhou velmi často používanou metodou je tzv, „transwell assay“ (Obr. 15). Prostor, ve kterém buňky migrují, sestává ze dvou komůrek umístěných svisle nad sebou, dno horní komůrky je tvořeno membránou s definovanými póry. Do horní komůrky se nasazují buňky, dolní obsahuje chemoatraktant, ke kterému jsou buňky přitahovány a v důsledku toho migrují skrze póry z horní komůrky do dolní. Počet buněk v dolní komůrce lze potom různými způsoby kvantifikovat.

Obr. 15 Princip „transwell assay“.

Jako poslední zmíníme mikroskopické komůrky pro chemotaxi (Obr. 16). Jsou to zvláštní podložní skla obsahující prostor pro buňky obklopený ze dvou stran komůrkami pro aplikaci média a roztoků. Tyto komůrky kombinují výhody obou předchozích metod. Podobně jako v případě „transwell assay“ migrují  buňky směrem k chemoatraktantu, tentokrát však vodorovně  a my máme možnost zachytit je ve skutečném čase na časosběrném záznamu.

Obr. 16 Mikroskopické komůrky pro chemotaxi dodávané firmou Ibidi. A) Sklíčko obsahuje tři migrační komůrky. Prostřední oddíl každé komůrky je určen pro buňky, dva trojúhelníkové prostory po stranách slouží k vytvoření gradientu chemoatraktantu. Buňky jsou snímány zespodu pomocí časosběrné mikroskopie. B) Buňky migrují směrem k chemoatraktantu, migrační dráhy jednotlivých buněk lze kvantifikovat pomocí softwarového nástroje. Zdroj: https://ibidi.com/content/232-chemotaxis.

Všechny popsané metody lze uzpůsobit také pro analýzu buněk ve 3D podmínkách. Buňky se v tomto případě nechávají migrovat v uměle připraveném gelu. Gel může být jednoduchý a obsahovat např. jen kolagen, nebo se může jednat o složitější kombinace molekul napodobující komplexní uspořádání ECM. Gel může dokonce obsahovat i různé typy dalších buněk, podobně jako je tomu in vivo u normálních a nádorových tkání. Takto modifikovaná metoda potom poskytuje výsledky lépe odpovídající skutečné situaci v organismu.